我们将限制性内切酶酶切的常见问题、可能原因及解决办法归纳如下表：
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常见问题 |
可能原因 |
解决办法 |
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DNA 完全没有被等内切酶切 |
内切酶失活 |
标准底物检测酶活性 |
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DNA 不纯，含有SDS ，酚，EDTA 等 |
将DNA 过柱纯化或乙醇沉淀DNA |
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条件不适(试剂、温度) |
检查反应系统是否最佳 |
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DNA 酶切位点上的碱基被甲基化 |
换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解， 重新将质粒DNA 转化至dcm-，dam-基因型的细菌菌株 |
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DNA 不存在该酶识别序列 |
换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验证 |
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DNA 切割不完全 |
内切酶活性下降 |
用5-10 倍量过量消化 |
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DNA 不纯，反应条件不佳 |
将DNA过柱纯化或乙醇沉淀DNA |
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内切酶识别的DNA 位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰 |
换用对DNA 甲基化不敏感的同裂酶酶解， 重新将质粒DNA 转化至dcm- ， dam-基因型的细菌菌株 |
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识别位点两侧插入了可影响酶切j效率的核酸序列 |
加大酶量5-10 倍 |
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DNA 片段数目多于土里论值 |
内切酶星号活性 |
检查反应条件: 甘油浓度大于12% ，盐浓度过低，Mn2+的存在及酶用量过大均可导致星号活性 |
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其它内切酶污染 |
用λDNA 作底物检查酶切结果 |
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底物中含其它DNA 杂质 |
电泳检查DNA ，换用其它酶酶切验证， 纯化DNA 片段 |
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酶切后电泳没有观察到DNA 片段 |
DNA 定量错误(如RNA 含量较高) |
用RNA 酶A( 无DNA 酶)1 00μg/mL 消化DN A 样品，盼抽挝后沉淀，溶解， 定量 |
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酶过量，酶切时间过长，或酶被污染 |
减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶 |
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电泳后DNA 片段的带型弥散， 不均 |
酶过量，酶切时间过长， 或酶被污染 |
减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶 |
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内切酶中含有DNA 外切酶 |
减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶 |
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DNA 条带缺失 |
磷酸盐的浓度过高 |
透析，乙醇沉淀去除磷酸盐 |
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内切酶失活不全或含有ATP酶 |
延长灭活时间或用酚抽提，乙醉沉淀回收DNA |
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外切酶污染 |
减少酶用量，缩短保温时间，盼抽提回收DNA |