信息
名称：人MTHFR基因多态性检测试剂盒（荧光PCR法）
货号：#MS601
规格：25人份/盒
价格：1200元/盒
产品应用
MTHFR基因编码合成5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶，能催化5,10-亚甲基四氢叶酸产生5-甲基四氢叶酸，参与甲基传递与核苷酸合成，是叶酸代谢过程中的关键酶。MTHFR基因位点突变对酶的活性和热稳定性影响很大，会造成叶酸水平降低及血液中同型半胱氨酸浓度升高，进而引起心脑血管疾病的发生、新生儿或胎儿神经管缺陷的风险也大大增加。c.677(C/T)是MTHFR最常见SNP位点，突变可造成位点编码的氨基酸由丙氨酸变成缬氨酸，纯合突变型（677TT）酶活性下降65％以上。本试剂盒通过病人外周血基因组DNA可定性检测出MTHFR基因型，为临床医生个体化用药提供指导。
检测原理
本试剂盒采用等位基因特异PCR与TaqMan荧光探针技术相结合的方法，检测MTHFR基因多态性。根据c.677(C/T)位点设计野生型和突变型引物，当模板与引物3末端完全匹配时，PCR反应才能高效的进行，产生荧光信号累积；反之则读取不到荧光信号或者CT值很高（低效扩增得到），野生型和突变型位点分管检测，通过扩增曲线和CT值判断MTHFR基因c.677(C/T)位点基因型。
主要组成
| 序号 | 名称 | 主要成份 | 体积 |
|---|---|---|---|
| 1 | 2×677C PCR反应液 | PCR缓冲液、特异性引物探针、内控引物探针 | 500 μl |
| 2 | 2×677T PCR反应液 | PCR缓冲液、特异性引物探针、内控引物探针 | 500 μl |
| 3 | 反应酶 | Taq DNA聚合酶、UNG酶、酶储存液 | 25 μl |
| 4 | 野生型质控品 | MTHFR 677C质粒及内控质粒 | 100 μl |
| 5 | 突变型质控品 | MTHFR 677T质粒及内控质粒 | 100 μl |
| 6 | 无核酸酶水 | / | 1 ml |
储存条件及有效期
-20℃避光保存，有效期10个月
样本要求
1. 样本类型：由外周静脉全血样本提取得到的人基因组DNA；
2. DNA质量：浓度10~200ng/μl，纯度OD260/280值在1.7~2.0之间，DNA样品-20℃保存时间不应超过6个月。
使用方法
1. 反应体系
| 体系组份 | 空白对照 | 阳性对照 | 阴性对照 | 待测样品 | 备注 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| PCR反应液 | 677C | 677T | 677C | 677T | 677C | 677T | 677C | 677T | 推荐根据实验需要提前将模板以外组份预混成两种体系的反应混合液。 |
| 12.5 μl | 12.5 μl | 12.5 μl | 12.5 μl | 12.5μl | 12.5μl | 12.5 μl | 12.5 μl | ||
| 反应酶 | 0.2 μl | 0.2 μl | 0.2 μl | 0.2 μl | 0.2 μl | 0.2 μl | 0.2 μl | 0.2 μl | |
| 无核酸酶水 | 10.3 μl | 10.3 μl | 10.3 μl | 10.3 μl | 10.3 μl | 10.3 μl | 10.3 μl | 10.3 μl | |
| 模板DNA | / | / | 2 μl野生型质控品 | 2 μl突变型质控品 | 2 μl突变型质控品 | 2 μl野生型质控品 | 2 μl样本DNA | 2 μl样本DNA | |
2. 反应程序
| 步骤 | 温度 | 时间 | 说明 |
|---|---|---|---|
| 1 | 50 ℃ | 2 min | 去除PCR产物污染 |
| 2 | 95 ℃ | 30 sec | 预变性 |
| 3 | 95 ℃ | 10 sec | 循环40次，设置FAM和HEX双通道采集荧光信号，采集点为60℃阶段（FAM为目的信号，HEX为内控信号）。 |
| 60 ℃ | 45 sec |
结果判读
| 677C反应体系和结果 | 677T反应体系和结果 | MTHFR c.677位点基因型 | |
|---|---|---|---|
| 样本1 | FAM信号呈S型曲线ΔCT(FAM-HEX)≤3 | CT(FAM)”Undetermined” 或ΔCT(FAM-HEX)＞3 | CC野生型 |
| 样本2 | FAM信号呈S型曲线ΔCT(FAM-HEX)≤3 | FAM信号呈S型曲线ΔCT(FAM-HEX)≤3 | CT杂合突变型 |
| 样本3 | CT(FAM)”Undetermined” | FAM信号呈S型曲线ΔCT(FAM-HEX)≤3 | TT纯合突变型 |
质量控制
1. 每次上机都需要做空白对照和质控检测；
2. 质控品CT(HEX)值和阳性对照CT(FAM)值均应小于28；
3. 空白对照应无扩增信号，FAM和VIC通道均检测不到荧光；当有扩增信号时，其CT(HEX)值和CT(FAM)值大于30为非特异性扩增属正常现象；
4. 若内控扩增曲线不呈S型或质控品ΔCT(FAM-HEX)＞3或阳性对照未检测到FAM荧光，则反应无效。
检测方法的局限性
本试剂盒不能直接用于检测全血样本，样本基因组DNA加入量不应低于20 ng；检测结果不作为临床诊治的唯一依据，对患者的临床管理应结合其症状、病史、治疗反应和流行病学等信息综合考虑。
实验图例
图1 MTHFR c.677位点 CC野生型
图2 MTHFR c.677位点 CT杂合突变型
图3 MTHFR c.677位点 TT纯合突变型