DNA模板、PCR体系以及扩增条件等因素都会对PCR反应产生影响，我们将这些常见问题及可能原因、对应的解决办法归纳如下表：
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常见问题 |
可能原因 |
解决问题 |
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无扩增产物 |
模板含有抑制物或含量低 |
纯化模板、使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 |
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Buffer 对样品不合适 |
更换Buffer 或调整浓度 |
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引物设计不当或者发生降解 |
重新设计引物(避免链问二聚体和链内二级结构)或者换一对新引物 |
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退火温度太高，延伸时间太短 |
降低返火温度、延长延伸时间 |
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非特异性 扩增 |
引物特异性差 |
重新设计引物或者使用巢式PCR |
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模板或引物浓度过高 |
适当降低模板或引物浓度 |
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酶量过多 |
适当减少酶量 |
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Mg2+浓度偏高 |
降低Mg2+浓度 |
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返火温度偏低 |
适当提高退火温度或使用二阶段温度法 |
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循环次数过多 |
减少循环次数 |
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拖尾 |
模板不纯 |
纯化模板 |
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Buffer 不合适 |
更换Buffer |
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退火温度偏低 |
适当提高退火温度 |
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假阳性 |
靶序列或扩增产物 的交叉污染 |
操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外 |
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除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒，所用的离心管及加样枪头等均应一次性使用 |
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各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存 |